L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶（Gal LDH）活性測定試劑盒說明書

微量法 100T/96S

正式測定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

L-半乳糖途徑是合成AsA 的主要途徑。Gal LDH 位于線粒體內(nèi)膜，負(fù)責(zé)催化植物體內(nèi) AsA 生物合成的最后一步，也是該途徑的關(guān)鍵酶之一，對植物體內(nèi)AsA 含量的積累起著至關(guān)重要的作用。

測定原理：

Gal LDH 催化L-半乳糖內(nèi)酯還原細(xì)胞se素C(Cyt c)，還原型 Cyt c 在 550nm 有吸收峰；測定還原型 Cyt c 增加速率，來計(jì)算Gal LDH 活性。

L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶活性測定試劑盒

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶（棕色），4℃保存。臨用前加入 16ml 蒸餾水，充分溶解。試劑三：粉劑×1 管，4℃保存。臨用前加入 2ml 蒸餾水，充分溶解。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液器、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。13000g，4℃離心 10min，取上清置冰上待測。

Gal LDH 測定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長到 550nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二在 25℃水浴鍋中預(yù)熱 30 min。

3. 依次在、微量玻璃比色皿/96 孔板中加入 20μl 上清液、160μl 預(yù)熱的試劑二和 20μl 試劑三，迅速混勻后于 550nm 比色，記錄 10s 和 130s 的吸光值A1 和A2，△A = A2﹣A1。

Gal LDH 活性計(jì)算公式：

使用 96 孔板測定的計(jì)算公式如下

(1). 按蛋白濃度計(jì)算

Gal LDH 活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘還原 1nmol Cyt c 為 1 個(gè)酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/mg prot) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（Cpr×V 樣）÷T

=578×△A ÷Cpr

(2). 按樣本質(zhì)量計(jì)算

Gal LDH 活性單位定義：25℃中每克樣品每分鐘還原 1nmol Cyt c 為 1 個(gè)酶活單位。

Gal LDH (nmol/min/g 鮮重) = △A÷ε÷d×V 反總×10⁹÷（W×V 樣÷V 樣總）÷T

=578×△A ÷W

ε：還原型 Cyt c 摩爾消光系數(shù)，17.3×10³L/ mol/cm；d：96 孔板光徑(cm)，0.5cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml=0.0002 L；10⁹：1mol=1×10⁹nmol；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl=0.02ml；V 樣總：提取液體積，1 ml；Cpr：上清液蛋白濃度，mg/ml，蛋白質(zhì)濃度需要另外測定，建議使用本公司蛋白質(zhì)含量BCA 試劑盒；T：反應(yīng)時(shí)間，2min。

注意事項(xiàng):

試劑二和試劑三配制好后 3 天內(nèi)使用完。

L-半乳糖酸-1,4-內(nèi)酯脫氫酶活性測定試劑盒