2x miRNAUniversal SYBR qPCR Mix (莖環(huán)法)

miRNA反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測(cè)試劑盒 

目錄號(hào):71501

產(chǎn)品內(nèi)容

保存條件

-20℃保存，有效期 24 個(gè)月。

使用前，充分融解，輕輕顛倒混勻，短期使用可放在 4 ℃，避免反復(fù)凍融。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

產(chǎn)品簡(jiǎn)介

2x miRNA Universal SYBR qPCR Mix（莖環(huán)法）是專門(mén)為莖環(huán)法miRNA定量檢測(cè)而研發(fā)的新一代預(yù)混形式的熒光定量PCR檢測(cè)試劑，其中的DNA polymerase 采用的是抗體修飾的熱啟動(dòng)形式， 配合特殊的Buffer 體系，使反應(yīng)特異性更好，靈敏度更高，并能在更廣的范圍內(nèi)進(jìn)行準(zhǔn)確定量。

預(yù)混液中含有通用型ROX，適用于所有qPCR儀，使用qPCR Mix時(shí)不需要額外添加ROX來(lái)校正儀器。

需要自備的試劑：

待檢測(cè)miRNA對(duì)應(yīng)的qPCR的引物

Realtime 上游引物設(shè)計(jì)：

miRNA序列除去3’端6個(gè)堿基 的剩余部分作為上游引物，如miR-1的上游引物為(注意 把U改為T(mén))：TGGAATGTAAAGAAGT.檢查引物的Tm 值（一般參考DNAMAN），如果Tm值較低，則在5’端加GC使Tm值接近60度。因此miR-1的上游引物可設(shè)計(jì) 為：GCGCTGGAATGTAAAGAAGT，61.4度。

下游引物是通用的，序列為GTGCAGGGTCCGAGGT。

引物設(shè)計(jì)好后，需要通過(guò)預(yù)試驗(yàn)檢測(cè)引物的特異性。一般需要做溶解曲線來(lái)檢測(cè)引物的特異性；同時(shí)最好將PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè)產(chǎn)物是否單一（產(chǎn)物長(zhǎng)度很短，需要3%以上的瓊脂糖膠）

操作步驟：

1. 在室溫融化2x miRNA qPCR Mix、primer（10μM）、DNA模板、ddH2O，并置于冰上備用。

2. 冰上配制qPCR反應(yīng)體系：（以20μl反應(yīng)體系為例）

1） 推薦模板加樣量為1-2μl / 20μl反應(yīng)體系，cDNA原液≤總反應(yīng)體系的10%。

2） 對(duì)于特殊的檢測(cè)體系中，高含量的cDNA 模板易導(dǎo)致非特異性擴(kuò)增，根據(jù)所檢測(cè)miRNA 的豐度適當(dāng)?shù)南♂宑DNA（10倍或者100倍）。

3） 通常推薦引物濃度為0.2 μM，就可以得到較好的結(jié)果，反應(yīng)效果不佳時(shí)可在0.1 - 1.0 μM范圍內(nèi)進(jìn)行調(diào)整。

擴(kuò)增效率不高的情況下，可提高引物濃度；發(fā)生非特異性反應(yīng)時(shí)，可降低引物濃度，由此優(yōu)化反應(yīng)體系。

3. qPCR反應(yīng)程序

注意：

1） 本產(chǎn)品兼容性強(qiáng)，絕大多數(shù)情況下使用二步法和三步法均可獲得良好效果。一般來(lái)說(shuō)，二步法擴(kuò)增特異性高，三步法擴(kuò)增效率高。如果融鏈曲線較差，可以嘗試兩步法擴(kuò)增或提高退火溫度；如果因使用Tm值較低的引物等原因，得不到良好的實(shí)驗(yàn)結(jié)果時(shí)，可嘗試加長(zhǎng)延伸時(shí)間或者進(jìn)行三步法PCR擴(kuò)增。

2） 根據(jù)引物的Tm值進(jìn)行退火&延伸（退火）溫度的設(shè)定；

3） 延伸（退火&延伸）時(shí)間的設(shè)置還需要根據(jù)您所使用的qPCR儀所需要的最短數(shù)據(jù)采集時(shí)間自行調(diào)整。

4） 融解曲線分析請(qǐng)以所使用的熒光定量PCR儀推薦的程序進(jìn)行設(shè)定。

miRNA反轉(zhuǎn)錄/熒光定量檢測(cè)試劑盒