線粒體檸檬酸（Mitochondrion citric acid, MCA）含量試劑盒說(shuō)明書(shū)

分光光度法

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

CA 是線粒體三羧酸循環(huán)的第一個(gè)中間產(chǎn)物，由檸檬酸合酶催化乙酰CoA 與草酰乙酸合成，其含量是三羧酸循環(huán)強(qiáng)度的主要指標(biāo)之一。配合測(cè)定丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性、乙酰 CoA 含量、檸檬酸合酶活性和 CA 含量，其中（1）丙酮酸含量和丙酮酸脫氫酶活性變化可以反映糖酵解進(jìn)行程度，（2）綜合分析丙酮酸含量、丙酮酸脫氫酶活性和乙酰CoA 含量變化可以反映脂肪酸β-氧化途徑提供的乙酰 CoA 情況，（3）乙酰CoA 含量、檸檬酸合酶活性和CA 含量變化可以反映三羧酸循環(huán)進(jìn)行狀況。

測(cè)定原理：

CA 在檸檬酸裂解酶的作用下，生成α-酮酸（草酰乙酸）；在弱酸性條件下，α-酮酸進(jìn)一步與苯肼反應(yīng)，生成相應(yīng)的α-酮酸苯腙；α-酮酸苯腙在 330nm 處有吸收峰，該波長(zhǎng)下吸光度的變化程度可反映出 CA 的含量。

線粒體檸檬酸含量試劑盒   三羧酸循環(huán)系列

組成：

BK6009-25T/24S：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 7.5ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存；標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1ml×1 支，10μmol/ml 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

BK6009-50T/48S：

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃保存；臨用前加入 15ml 蒸餾水充分溶解待用；用不完的試劑 4℃保存。標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1ml×1 支，10μmol/ml 檸檬酸標(biāo)準(zhǔn)液，4℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書(shū)的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

分光光度計(jì)、水浴鍋、可調(diào)式移液槍、1ml 石英比色皿、研缽和蒸餾水。

線粒體中檸檬酸提取：

稱(chēng) 0.05~0.1g 樣品（建議稱(chēng) 0.1g 樣本），加入 0.5ml 酸性提取液，冰上充分研磨，600g/min 4℃離心 5min；取上清至另一EP 管中，11000g/min 4℃離心 10min，棄上清（取 300μl 該上清液和 300μl 堿性提取液中和后可用于細(xì)胞質(zhì)CA 含量測(cè)定）；沉淀即線粒體，向沉淀中加入 0.5ml 酸性提取液，充分懸浮溶解，超聲波破碎（功率 20％，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復(fù) 30 次），取此溶液 300μl 和 300μl 堿性提取液中和，混勻，置冰上待測(cè)（不可用于蛋白質(zhì)含量測(cè)定）。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30 min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 330nm，蒸餾水調(diào)零。

2、試劑一、二和三 37℃預(yù)熱 10min。

3、樣本測(cè)定：

空白管和標(biāo)準(zhǔn)管通常只需要各做一個(gè)。

充分混勻，330nm 立即測(cè)定初始吸光值A1 和 37℃孵育 30min 后的吸光值A2，ΔA=A2 –A1。

檸檬酸含量計(jì)算：

（1） 按蛋白濃度計(jì)算

檸檬酸含量(μmol/mg prot)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（V 樣÷Cpr）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷Cpr蛋白質(zhì)含量需要另外測(cè)定。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算

檸檬酸含量(μ mol/g 鮮重)=[C 標(biāo)準(zhǔn)管×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管) ×V 樣]÷（W×V樣÷V 樣總）=10×(ΔA 測(cè)定管－ΔA 空白管)÷(ΔA 標(biāo)準(zhǔn)管－ΔA 空白管)÷W

C 標(biāo)準(zhǔn)管：標(biāo)準(zhǔn)液濃度，10μmol/ml； V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.3ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；Cpr：樣品蛋白濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g。注意：zui低檢測(cè)限為 10nmol/mg prot 或 1μmol/g 鮮重。

線粒體檸檬酸含量試劑盒   三羧酸循環(huán)系列