3-磷酸甘油酸激酶（3-Phosphoglycerate kinase，PGK）試劑盒說(shuō)明書

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

3-磷酸甘油酸激酶是糖酵解的關(guān)鍵酶，廣泛存在于動(dòng)植物和微生物體內(nèi)，催化 1，3-二磷酸甘油酸轉(zhuǎn)變?yōu)?/span> 3-磷酸甘油酸，產(chǎn)生 1 分子ATP，具有影響 DNA 復(fù)制和修補(bǔ)及刺激病毒 RNA 合成等生物學(xué)功能，廣泛應(yīng)用于藥物靶標(biāo)設(shè)計(jì)。

測(cè)定原理：

3-磷酸甘油酸激酶催化 3-磷酸甘油酸和ATP 產(chǎn)生 1,3-二磷酸甘油酸和ADP，1,3-二磷酸甘油酸在 3-磷酸甘油醛脫氫酶和 NADH 作用下產(chǎn)生 3-磷酸甘油醛、NAD 和磷酸，340nm 處的吸光度變化反映了 3-磷酸甘油酸激酶的活性的高低。

3-磷酸甘油酸激酶試劑盒   光合系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 2ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑三：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑四：粉劑×1 支，-20℃避光保存。臨用前加 1 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

試劑五：粉劑×1 瓶，-20℃避光保存。臨用前加 4 ml 蒸餾水充分溶解；用不完的試劑分裝后-20℃保存，禁止反復(fù)凍融。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

天平、低溫離心機(jī)、研缽、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板。

酶液提取：

①總 PGK 酶提?。?/span>建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液，冰浴勻漿后超聲破碎（冰浴，200W，破碎3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，500g 離心 5min，取上清測(cè)定。

②胞漿和葉綠體 PGK 酶的分離：按照植物組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5～10 的比例（建議稱取約 0.1g 樣本，加入 1ml 提取液），冰浴勻漿后于 4℃，500g 離心 5min，棄沉淀，取上清在 4℃，8000g離心 10min，取上清用于測(cè)定胞漿 PGK 酶活性，取沉淀加 1ml 提取液，震蕩溶解后超聲破碎（冰浴， 200W，破碎 3s，間歇 7s，總時(shí)間 1min），然后 4℃，500g 離心 5min，取上清測(cè)定葉綠體中 PGK 酶活性。

建議測(cè)定總 PGK 酶活性，按照步驟①提取粗酶液，若需要分別測(cè)定胞漿和葉綠體中的 PGK，則按照步驟②提取粗酶液。

測(cè)定操作：

1、分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

1. 取微量石英比色皿/96 孔板，依次加入 100μl 試劑一，20μl 試劑二，10μl 試劑三，10μl 試劑四，40μl試劑五，20μl 粗酶液，充分混勻，記錄 340nm 處 10s 的吸光值A1 和 310s 的吸光值A2，△A=A1-A2

計(jì)算公式：

a. 用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=321.54×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=321.54×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

b. 用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

酶活單位定義：每毫克組織蛋白每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /mg prot）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(V 樣×Cpr) ÷T=643.08×ΔA÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

酶活單位定義：每克組織每分鐘消耗 1 nmol 的NADH 定義為一個(gè)酶活力單位。

PGK（nmol/min /g 鮮重）＝ΔA÷（ε×d）×V 反總÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=643.08×ΔA÷W

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，0.5cm； V 樣：加入樣本體積，0.02ml；V 樣總：加入提取液體積，1ml；T：反應(yīng)時(shí)間，5 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g

3-磷酸甘油酸激酶試劑盒   光合系列