植酸酶（phytase）試劑盒說明書

分光光度法 50 管/24 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測定測定意義：

植酸酶（phytase）是催化植酸及其鹽類水解為肌醇與磷酸（鹽）的一類酶的總稱，屬磷酸單酯水解酶，它能將食品和飼料中植酸及其鹽轉(zhuǎn)化為可供有機體利用的有效磷，降低糞便中的磷含量，減輕對環(huán)境的污染，改善營養(yǎng)成分的吸收和利用，因此具有極其廣泛的研究和應(yīng)用價值。

測定原理：

植酸酶在一定溫度和pH 值條件下，水解底物植酸鈉生成無機磷與肌醇衍生物，無機磷在酸性環(huán)境中與鉬酸銨顯色劑反應(yīng)生成藍色復(fù)合物，在 700nm 處有特征吸收峰，根據(jù) 700nm 處吸光值變化可計算得植酸酶活性。

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試劑組成和配制：

試劑一：粉劑×1 瓶，4℃保存，臨用前加緩沖液 10ml 配制，現(xiàn)用現(xiàn)配；用不完的試劑 4℃保存一個月。顯色劑：粉劑×6 瓶，4℃保存，臨用前根據(jù)用量每瓶加 1ml 雙蒸水溶解，再加 4ml 試劑二混勻。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

需自備儀器和用品：

天平、低溫離心機、可見分光光度計、1 ml 玻璃比色皿、恒溫水浴鍋，超聲溶解器，回旋式振蕩器。

樣本處理：

1. 酶制劑：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：500~1000 的比例（建議稱取約 0.001g，加入 1ml提取液）加入提取液，在超聲波溶解器上溶解 15min，再用回旋式振蕩器振蕩 15min，待測。

2. 組織：按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）進行冰浴勻漿，在超聲波溶解器上溶解 15min，再用回旋式振蕩器振蕩 15min，4℃，4000g 離心 10min，取上清待測。

3. 飼料樣品：飼料烘干粉碎，過 40 目篩，按照質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g，加入 1ml 提取液）進行冰浴勻漿，在超聲波溶解器上溶解 15min，再用回旋式振蕩器振蕩 15min，4℃，4000g 離心 10min，取上清待測。

4. 培養(yǎng)液等液體樣品，混勻直接測定。

測定步驟：

37℃溫育 5min

混勻，37℃溫育 30min，95℃，10min 終止反應(yīng)，冷卻至室溫

混勻，37℃靜置 15min，10000g，室溫，離心 5min，取上清，蒸餾水調(diào)零，測定 700nm 處吸光值，

△A=A 測定管-A 對照管。每個測定管設(shè)一個對照管。

注意事項

1、顯色劑需要臨用前根據(jù)用量配制，每一瓶是 10 個樣本的用量，新配制的顯色劑若有顏色則已經(jīng)污染或者試劑過期，應(yīng)放棄使用。

2、ΔA 線性范圍為 0.01-2。

酶活性計算公式：

（一）NADP⁺含量的計算

標(biāo)準(zhǔn)曲線：y = 0.2764x + 0.0082，R2 = 0.9998；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值。按照蛋白濃度計算

酶活性定義：在 37℃，pH5.5 的條件下，每毫克蛋白每分鐘從 5mmol/L 的植酸鈉溶液中釋放出 1μmol的無機磷為一個酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min/mg prot）=（△A-0.0082）÷0.2764÷Cpr÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷Cpr2．按照樣本質(zhì)量計算

酶活性定義：在 37℃，pH5.5 的條件下，每克樣本每分鐘從 5mmol/L 的植酸鈉溶液中釋放出 1μmol的無機磷為一個酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min /g 鮮重）=（△A-0.0082）÷0.2764÷W÷T =0.1206×（△A-0.0082）÷W

3. 培養(yǎng)液等液體樣品

酶活性定義：在 37℃，pH5.5 的條件下，每毫升液體每分鐘從 5mmol/L 的植酸鈉溶液中釋放出 1μmol的無機磷為一個酶活力單位。

植酸酶活性（μmol/min /ml）=（△A-0.0082）÷0.2764÷T =0.1206×（△A-0.0082）

Cpr：樣本蛋白含量，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；T：反應(yīng)時間，30min。

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