TOPO-Blunt Lightning Cloning Kit（含酶切位點(diǎn)）

TOPO-BluntLightningCloningKitTOPO載體

目錄號：42116

產(chǎn)品內(nèi)容：

保存條件：

-20℃，存放 12 個月，不影響使用效果。

產(chǎn)品簡介：

可在室溫條件下，20分鐘完成TA克隆或Blunt克隆，陽性率接近100%，并且免冰浴、免熱激、免藍(lán)白斑篩選，還可以連接長達(dá)10kb的DNA片段。

克隆步驟（≤3kb 片段）：               簡化步驟（≤10kb 片段）-- 免復(fù)蘇，免液體 LB

1、連接：室溫 5 分鐘；                      1、連接: 37℃連接 5 min。

2、轉(zhuǎn)化：室溫 5 分鐘；                      2、轉(zhuǎn)化：冰浴 5 min，42℃熱激 1 min，冰上 2 min。

3、復(fù)蘇：180rpm、37℃振蕩培養(yǎng) 10 分鐘；涂板。 3、取全部菌液涂板，37℃倒置培養(yǎng)。

操作步驟：

1.         PCR 產(chǎn)物的制備：

a.       引物要求：引物不能磷酸化。

b.     酶的選擇：根據(jù)需要選擇DNA 聚合酶，該載體兼容PCR 產(chǎn)物的A 末端和平末端。

c.        電泳檢測 PCR 產(chǎn)物的量和質(zhì)量：

①僅有目的條帶，可直接進(jìn)行連接反應(yīng)，無需純化；

②如果有多條帶，建議凝膠回收 DNA 片段（DC011-100）;

③如果以質(zhì)粒為模板的擴(kuò)增，則必須進(jìn)行凝膠回收，因為模板質(zhì)粒也會長出非目的菌落。

2.         連接反應(yīng)：

1）室溫（20℃-37℃）建立連接體系（10ul 體系）：

不同大小插入片段的推薦用量：

加完試劑后，輕彈管底混勻（或輕輕吹打混勻），點(diǎn)甩離心收集所有液體在離心管底。

2) 室溫（20℃-37℃）連接 5 分鐘。連接產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化感受態(tài)細(xì)胞，或置于冰上備用。

3.         轉(zhuǎn)化、復(fù)蘇、涂板：

1）100ul 感受態(tài)細(xì)胞，置于室溫解凍（約 1 分鐘左右），輕撣幾次將細(xì)胞均勻懸浮。

2）      加入 10ul 連接液，輕輕混勻，室溫（20℃-37℃）放置 5 分鐘。

3）      加入 500ul 平衡至室溫的 LB 或者 SOC 培養(yǎng)基(不含抗生素)，37℃ 180 rpm 振蕩培養(yǎng) 10 min。

（注意：大于 3kb 的片段，振蕩培養(yǎng)時間延長至 30-60 分鐘，可以增加轉(zhuǎn)化子。或者用簡化步驟）

4）        取 200?l 菌液涂板(含氨芐青mei素 50-100ug/ml），培養(yǎng)過夜。（為得到較多克隆，4000 rpm 離心 1 min，吸棄掉部分上清，保留 100-150ul，輕彈懸浮菌體，取全部菌液涂板）

注意：如果使用 5ul 體系，各成分按照比例減半，使用次數(shù)可以加倍。

4.         轉(zhuǎn)化子的篩選鑒定：

本制品陽性率相當(dāng)高，一般情況下，可以達(dá)到所見即所得，只要是長出來的菌落正常（不是污染的雜菌，轉(zhuǎn)化子數(shù)量也不算太少），基本就包含插入。因此插入片段不超過 2-3kb 的情況下可以不用鑒定直接挑 1-2 個菌去測序。

1）    菌落 PCR 檢測：挑單菌落于 10ul 無菌水中，混勻，取 1ul 置于 25ul PCR 體系,用 PCR 引物或者M13 通用引物去鑒定陽性克隆。

2）用通用 M13F（-20）/M13R（-26）引物測序來確定是否含有目的克隆。

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