順烏頭酸酶（ACO）活性檢測試劑盒說明書

分光光度法 50 管/48 樣

正式測定前務必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

順烏頭酸酶（aconitase），三羧酸循環(huán)中的酶，催化檸檬酸轉(zhuǎn)變?yōu)楫悪幟仕?。檸檬酸本身不易氧化，在順烏頭酸酶作用下，通過脫水與加水反應，使羥基由β碳原子轉(zhuǎn)移到α碳原子上，生成易于脫氫氧化的異檸檬酸，為進一步的氧化脫羧反應作準備。

測定原理：

ACO 催化檸檬酸轉(zhuǎn)化成異檸檬酸，異檸檬酸氧化脫羧將 NAD⁺ 還原生成NADH，導致 340nm 處光吸收上升。

順烏頭酸酶活性檢測試劑盒   三羧酸

組成：

試劑六：粉劑×1 支，-20℃保存；臨用前加 3ml 蒸餾水充分溶解；現(xiàn)配現(xiàn)用

試劑七：粉劑×1 支，4°保存；臨用前加 36ml 試劑四充分溶解；

工作液：臨用前在 36ml 試劑七中加入 3ml 蒸餾水、3ml 試劑四、3ml 試劑五、3ml 試劑六充分混勻

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準

自備儀器和用品：

紫外分光光度計、水浴鍋、臺式離心機、可調(diào)式移液器、1ml 石英比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

樣本的前處理：

組織、細菌或細胞中胞漿蛋白與線粒體蛋白的分離：

1、 稱取約 0.1g 組織或收集 500 萬細胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、 將勻漿轉(zhuǎn)入離心管內(nèi) 600g，4℃離心 5min。

3、 棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、 上清液即胞漿提取物，可用于測定胞質(zhì)順烏頭酸酶活性。

5、 在步驟④的沉淀中加入 200μl 試劑二和 2μl 試劑三，超聲波破碎（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3 秒，間隔 10 秒，重復 30 次），用于線粒體順烏頭酸酶活性測定。

測定步驟:

1、分光光度計預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 340nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測定

（1）將工作液，置于 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）水浴 10min；現(xiàn)配現(xiàn)用；若分次用將工作液分裝后于-20°保存，一星期內(nèi)可用。

（3）在 1ml 石英比色皿中加入 100μl 樣本 900μl 工作液，混勻，立即記錄 340nm 處 20s 時的吸光值A1 和

3min20s 后的吸光值A2，計算ΔA=A2-A1。

ACO 活性計算:

用石英比色皿測定的計算公式如下

（1） 按樣本蛋白濃度計算

單位的定義：每mg 組織蛋白每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/mg prot）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(Cpr×V 樣) ÷T=536×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位的定義：每g 組織每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活性單位。

ACO（nmol/min/g 鮮重）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(W ×V 樣÷V 樣總) ÷T=108×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位的定義：每 1 萬個細菌或細胞每分鐘生成 1 nmol 的NADH 定義為一個酶活性單位。

ACO 活性（nmol/min/10⁴ cell）＝[ΔA×V 反總÷（ε×d）×10⁹]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T=0.722×ΔA

V 反總：反應體系總體積，0.001 L；ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³ L / mol /cm；d：比色皿光徑，1cm； V 樣：加入樣本體積，0.1 ml；V 樣總：加入提取液體積，0.202 ml；T：反應時間，3min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

順烏頭酸酶活性檢測試劑盒   三羧酸