谷an酰胺酶(glutaminase, GLS) 活性測(cè)定試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

GLS（EC 3.5.1.1）是酰胺基水解酶，催化天冬酰an水解成谷an酸和氨，在氮素代謝中具有重要調(diào)控作用，尤其是調(diào)節(jié)游離氨含量和尿素代謝。

測(cè)定原理：

GLS 催化谷an酰胺水解成 L-谷an酸和氨，利用奈氏試劑檢測(cè)氨增加的速率，即可計(jì)算其酶活性。

谷an酰胺酶活性測(cè)定試劑盒   氮代謝系列

組成：

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

臺(tái)式離心機(jī)、酶標(biāo)儀、96 孔板、可調(diào)式移液槍、研缽、冰和雙蒸水。

粗酶液提取：

1、細(xì)菌、細(xì)胞或組織樣品的制備：

細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 試劑一），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一），進(jìn)行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、血清（漿）樣品：直接檢測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 420nm。

2、樣品測(cè)定（在 EP 管中加入下列試劑）：

混勻，37℃水浴 1 小時(shí)

混勻，8000 g，25℃離心 10 min；取上清液，在 96 孔板中加入下列試劑

混勻，室溫靜置 15min，420nm 處讀取測(cè)定管和對(duì)照管吸光值，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定管-A 對(duì)照管。對(duì)照管只要做一管。

注意：

1、試劑六如出現(xiàn)沉淀，靜置后取上清使用。

2、ΔA（A 測(cè)定管-A 對(duì)照管）若出現(xiàn)負(fù)值，可能是酶活性較低，可將反應(yīng)時(shí)間 1h 延長(zhǎng)到 2h，相應(yīng)的在計(jì)算公式中除以 2。

酶活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y = 1.9244x + 0.0057，R² = 0.9983；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（μmol/ml），y 為吸光值A。

1、血清（漿）GLS 活性

單位定義：每 ml 血清（漿）每 min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。GLS(nmol /min /ml)

＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反總÷V 樣÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)

2、組織、細(xì)菌或細(xì)胞 GLS 活性

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位定義：每mg 蛋白質(zhì)每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol /min /mg prot)＝ (ΔA-0.0057) ÷1.9244×V 反總÷(V 樣×Cpr)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷Cpr。

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位定義：每g 組織每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol/min /g 鮮重)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反總÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T×1000=363.7×(ΔA -0.0057)÷W。

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算

單位定義：每 1 萬個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每min 催化谷an酰胺生成 1nmol 氨定義為一個(gè)酶活力單位。

GLS(nmol/min/10⁴ cell)＝(ΔA-0.0057)÷1.9244×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總) ÷T ×1000 =0.7274×(ΔA

-0.0057)

V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，60min；V 反總：反應(yīng)體系總體積，1.05ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.025ml；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量，g；500：細(xì)菌或細(xì)胞總數(shù)， 500 萬; 1000，μmol 到nmol 換算系數(shù)。

谷an酰胺酶活性測(cè)定試劑盒   氮代謝系列