乙醇脫氫酶（ADH）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)

微量法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

ADH 是生物體內(nèi)短鏈醇代謝的關(guān)鍵酶，催化乙醇與乙醛可逆轉(zhuǎn)換，在很多生理過(guò)程中起著重要作用。哺乳動(dòng)物ADH 主要在肝臟生成，肝臟損傷導(dǎo)致ADH 釋放到血清中。血清ADH 活性高低反映了肝功能是否異常。

測(cè)定原理：

ADH 催化NADH 還原乙醛生成乙醇和NAD⁺，NADH 在 340nm 處有吸收峰，而 NAD⁺沒(méi)有；測(cè)定 340nm吸光度下降速率，來(lái)計(jì)算ADH 活性。

乙醇脫氫酶活性測(cè)定試劑盒 輔酶Ⅰ系列

組成：

試劑三：粉劑×2 瓶，－20℃保存，臨用前每瓶加入 9ml 試劑二，現(xiàn)配現(xiàn)用。

自備儀器和用品：

研缽、冰、低溫離心機(jī)、紫外分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量石英比色皿/96 孔板、可調(diào)式移液器和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）進(jìn)行冰浴勻漿。16000g，4℃離心 20min，取上清置冰上待測(cè)。

2、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；16000g， 4℃離心 20min，取上清液置冰上待測(cè)。

3、血清等液體：直接測(cè)定。

ADH 測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30 min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 340 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑三在 25℃水浴中保溫 30 min。

3. 在微量石英比色皿/96 孔板中依次加入 20μl 樣本上清液、160μl 試劑三和 20μl 試劑四，迅速混勻后于340nm 測(cè)定吸光值變化，分別記錄 15s 和 75s 時(shí)吸光值，分別記為 A1 和A2?！鰽 測(cè)定管=A1-A2。

計(jì)算公式：

a. 使用微量石英比色皿測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷(Cpr×V 樣)÷T

=1608×△A ÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹)÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A ÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) = (△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=1608×△A ÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷V 樣÷T

=1608×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：比色皿光徑，1 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl=0.02 ml； V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

b. 使用 96 孔板測(cè)定的計(jì)算公式如下

（1） 按照蛋白濃度計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫克蛋白每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/mg prot) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(Cpr×V 樣)÷T

=3215×△A÷Cpr

（2） 按照樣本質(zhì)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每克組織每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/g 鮮重) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=3215×△A÷W

（3） 按細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

活性單位定義：25℃中每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/10⁴cell) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷(細(xì)胞數(shù)量×V 樣÷V 樣總)÷T

=3215×△A÷細(xì)胞數(shù)量

（4） 按液體體積計(jì)算

活性單位定義：25℃中每毫升血清每分鐘氧化 1nmol NADH 為 1 個(gè)酶活單位。

ADH (nmol/min/ml) =(△A÷ε÷d×V 反總×10⁹) ÷V 樣÷T

=3215×△A

ε：NADH 摩爾消光系數(shù)，6.22×10³L/mol/cm；d：96 孔板光徑，0.5 cm；V 反總：反應(yīng)體系總體積，200μl=2×10^-4 L；Cpr：上清液蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W ：樣品質(zhì)量；V 樣：加入反應(yīng)體系中上清液體積，20μl=0.02 ml； V 樣總：提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時(shí)間，1min。

乙醇脫氫酶活性測(cè)定試劑盒 輔酶Ⅰ系列