線粒體活性氧產(chǎn)生速率(ROS)檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)

熒光法 100T/96S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

活性氧(Reactive oxygen species, ROS)包括超氧自由基、過(guò)氧化氫、及其下游產(chǎn)物過(guò)氧化物和羥化物等，研究表明，機(jī)體 95％以上的活性氧（ROS）都來(lái)自于線粒體，其失衡所致的氧化應(yīng)激與細(xì)胞生長(zhǎng)增殖、發(fā)育分化、衰老和凋亡以及許多生理和病理過(guò)程有關(guān)。

正常情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化防御系統(tǒng)與氧自由基處于平衡狀態(tài)，細(xì)胞內(nèi)活性氧（ROS）水平維持在較低的生理范圍；在病理情況下，細(xì)胞內(nèi)抗氧化系統(tǒng)與氧自由基的平衡被打破，細(xì)胞內(nèi)活性氧水平過(guò)多，就可破壞線粒體酶類(lèi)、脂類(lèi)和核酸，使機(jī)體出現(xiàn)氧化應(yīng)激，同時(shí)，活性氧還可攻擊線粒體DNA 產(chǎn)生氧化損傷，導(dǎo)致線粒體ATP 合成減少、線粒體膜電位破壞等結(jié)構(gòu)和功能變化。因此，通過(guò)檢測(cè)活性氧的變化來(lái)判斷線粒體的功能是否正常具有重要意義。

測(cè)定原理：

熒光探針-還原型二氯熒光素 (2', 7'-dichlorodihy drofluorescin diacetate, DCFH-DA)可擴(kuò)散通過(guò)線粒體 膜，在線粒體內(nèi)被酯酶水解，形成無(wú)熒光的 DCFH，DCFH 迅速與ROS 反應(yīng)生成熒光物—氧化型二氯熒光素(2', 7'-dichlo rofluorescin, DCF)。 根據(jù)上述原理設(shè)計(jì)了利用熒光法直接定量檢測(cè)線粒體ROS 產(chǎn)生速率的方法。將熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)擬合，線性回歸直線斜率與ROS 產(chǎn)生的速率呈正比。

線粒體活性氧產(chǎn)生速率(ROS)檢測(cè)試劑盒 抗氧

組成：

自備儀器和用品：

多功能酶標(biāo)儀、恒溫培養(yǎng)箱、分析天平、可調(diào)式移液器、冰、蒸餾水。

線粒體提?。?/span>

1、準(zhǔn)確稱(chēng)取 0.1g 組織或收集 500 萬(wàn)細(xì)胞，加入 1ml 試劑一和 10μl 試劑三，用冰浴勻漿器或研缽勻漿。

2、將上述勻漿液于 600g（離心率），4℃離心 5min。

3、棄沉淀，將上清液移至另一離心管中，11000g，4℃離心 10min。

4、棄上清，沉淀中加入 200μl 試劑二重懸。

測(cè)定步驟：

1、多功能酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)激發(fā)光 499nm，發(fā)射光 521nm。

2. 在黑色不透光 96 孔板中加入下列試劑

孵育完成后，在 37℃恒溫下測(cè)定 10min 內(nèi)熒光強(qiáng)度，激發(fā)波長(zhǎng) 499nm，發(fā)射波長(zhǎng) 521nm，記錄 10min 內(nèi)的熒光值變化。

ROS 產(chǎn)生速率計(jì)算：

對(duì)采樣數(shù)據(jù)點(diǎn)即熒光強(qiáng)度隨時(shí)間的變化進(jìn)行線性回歸擬合處理 ,計(jì)算出回歸系數(shù),即直線斜率（k）。實(shí)際線粒體ROS 產(chǎn)生速率等于樣本熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變化的數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸直線斜率(k 測(cè)定)減去本底熒光強(qiáng)度隨時(shí)間變的數(shù)據(jù)點(diǎn)線性回歸直線斜率（k 空白）。

(1) 按樣本鮮重計(jì)算：每 g 組織線粒體每秒鐘熒光單位的變化,即u/ s/g 鮮重

ROS 產(chǎn)生速率(u/ s/g 鮮重)=(k 測(cè)定-k 空白)/(V 樣÷V 總×W）=10×(k 測(cè)定-k 空白)÷W

(2) 按樣本蛋白濃度計(jì)算：每毫克蛋白線粒體每秒鐘熒光單位的變化 u/ s/mg prot。

ROS 產(chǎn)生速率(u/ s/ mg prot)=(k 測(cè)定-k 空白)/(V 樣÷V 總×Cpr）=10×(k 測(cè)定-k 空白)÷Cpr

V 樣：加入樣本體積，0.02 ml；V 樣總：懸液體積，0.2 ml；W: 樣本鮮重，g；Cpr: 樣本蛋白濃度，mg/ml。

線粒體活性氧產(chǎn)生速率(ROS)檢測(cè)試劑盒 抗氧