過氧化物酶(Peroxidase，POD)試劑盒說明書

微量法 100 管/96 樣

正式測定前務(wù)必取 2-3 個預期差異較大的樣本做預測定測定意義：

POD（EC 1.11.1.7）廣泛存在于動物、植物、微生物和培養(yǎng)細胞中，可催化過氧化氫氧化酚類和胺類化合物，具有消除過氧化氫和酚類、胺類毒性的雙重作用。

測定原理：

POD 催化H2O2 氧化特定底物，在 470nm 有特征光吸收。

組成：

過氧化物酶試劑盒 微量法 抗逆系列

自備儀器和用品：

可見分光光度計/酶標儀、臺式離心機、可調(diào)式移液器、微量石英比色皿/96 孔板、研缽、冰和蒸餾水

粗酶液提取：

1、細菌、細胞或組織樣品的制備：

細菌或培養(yǎng)細胞：先收集細菌或細胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細菌或細胞數(shù)量（10⁴ 個）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬細菌或細胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細菌或細胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復 30 次）；8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進行冰浴勻漿。8000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測。

2、血清（漿）樣品：直接檢測。

測定步驟：

1、分光光度計或酶標儀預熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長至 470nm，蒸餾水調(diào)零。

2、工作液的配制：臨用前將試劑一、試劑二、試劑三按照 2.6（ml）：1.5（μl）：1（μl）的比例混勻；在 37℃（哺乳動物）或 25℃（其它物種）預熱 10min 以上；現(xiàn)配現(xiàn)用。

3、在微量石英比色皿或 96 孔板中加入 10μl 樣本和 190μl 工作液，混勻，記錄 470nm 下 1min 時吸光值A1 和 2min 后的吸光值A2。計算ΔA＝A2-A1。

注意：

如果ΔA 小于 0.005，可將反應(yīng)時間延長到 5min。如果ΔA 大于 0.5，可將樣本用提取液稀釋后測定，計算公式中乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)。

POD 活性計算：

用微量石英比色皿測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 ml 血清（漿）在每 ml 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。計算公式：

POD（U/ml）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.01÷T =2000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.01÷T =2000×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =2000×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.01 為一個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.01÷T =4×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml； V 樣：加入樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

用 96 孔板測定的計算公式如下

1、血清（漿）POD 活性

單位定義：每 ml 血清（漿）在每 ml 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。

POD（U/ml）=ΔA×V 反總÷V 樣÷0.005÷T =4000×ΔA

2、組織、細菌或細胞POD 活性

(1) 按樣本蛋白濃度計算

單位定義：每 mg 組織蛋白在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘 A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。

POD（U/mg prot）＝ΔA×V 反總÷（V 樣×Cpr）÷0.005÷T =4000×ΔA÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計算

單位定義：每 g 組織在每ml 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。

POD（U/g 鮮重）＝ΔA×V 反總÷(W× V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =4000×ΔA÷W

（3） 按細菌或細胞密度計算

單位定義：每 1 萬個細菌或細胞在每 ml 反應(yīng)體系中每分鐘A470 變化 0.005 為一個酶活力單位。

POD（U/10⁴ cell）＝ΔA×V 反總÷(500×V 樣÷V 樣總)÷0.005÷T =8×ΔA

V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.2ml； V 樣：加入樣本體積，0.01ml；V 樣總：加入提取液體積，1 ml；T：反應(yīng)時間，1 min；Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；W：樣本質(zhì)量；500：細菌或細胞總數(shù)，500 萬。

過氧化物酶試劑盒 微量法 抗逆系列