中性蛋bai酶（Neutral protease, NP）活性測(cè)定試劑盒說(shuō)明書

微量法 100T/48S

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

NP 在一定的溫度和中性pH 條件下，催化水解蛋白質(zhì)。由于其安全無(wú)毒、水解能力強(qiáng)、作用范圍廣等特點(diǎn)，中性蛋bai酶常用于食品、飼料、化妝品和營(yíng)養(yǎng)保健品生產(chǎn)。

測(cè)定原理：

中性條件下，NP 催化酪蛋白水解產(chǎn)生酪an酸；在堿性條件下，酪an酸還原磷鉬酸化合物生成鎢藍(lán)；在 680nm 有特征吸收峰。

中性蛋bai酶活性測(cè)定試劑盒   離子系列

組成：

試劑二：粉劑×1 瓶，4℃保存。臨用前加 4ml 蒸餾水溶解。

試劑三：粉劑×1 瓶，4℃避光保存。臨用前加入 10ml 試劑一，沸水浴中磁力攪拌溶解。（可在燒杯上蓋一層保鮮膜，注意觀察，避免水分全部蒸發(fā)，一般加熱 15-30 分鐘，該試劑為過(guò)飽和試劑，充分混勻后仍出現(xiàn)顆粒物不溶物不影響使用）。

試劑四：粉劑×1 瓶， 4℃保存。臨用前加 20ml 蒸餾水溶解。

標(biāo)準(zhǔn)品：液體 1ml×1 支，0.25μmol/ml 標(biāo)準(zhǔn)酪an酸溶液，4℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀、微量玻璃比色皿/96 孔板、水浴鍋、磁力攪拌器、可調(diào)式移液槍、1.5 ml EP管和蒸餾水。

粗酶液提取：

1、組織：按照組織質(zhì)量（g）：試劑一體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 試劑一）冰浴勻漿，8000g，4℃離心 10min，取上清，即粗酶液。

2、血清或培養(yǎng)液：直接測(cè)定。

3、細(xì)菌、真菌：按照細(xì)胞數(shù)量（104 個(gè)）：試劑一體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)胞加入 1ml 試劑一），冰浴超聲波破碎細(xì)胞（功率 300w，超聲 3 秒，間隔 7 秒，總時(shí)間 3min）；然后 8000g， 4℃，離心 10min，取上清置于冰上待測(cè)。

測(cè)定操作：

1. 分光光度計(jì)/酶標(biāo)儀預(yù)熱 30min，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)到 680 nm，蒸餾水調(diào)零。

2. 試劑二、試劑三和試劑四置于 30℃水浴保溫 30min。

3. 對(duì)照管：取 0.5 ml EP 管，加入 20μl 粗酶液，40μl 試劑二，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 40μl試劑三，混勻后 8000g，4℃離心 10min；取 40μl 上清液，加入新的EP 管，再加入 200μl 試劑四，40μl 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為A 對(duì)照管。

4. 測(cè)定管：取 0.5 ml EP 管，加入 20μl 粗酶液，40μl 試劑三，混勻后置于 30℃水浴保溫 10min；加入 40μl試劑二，混勻后 8000g， 4℃離心 10min；取 40μl 上清液，加入新的EP 管，再加入 200μl 試劑四，40μl試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為A 測(cè)定管。（注意與空白管不同，先加試劑三，后加試劑二）

5. 空白管：取 0.5 ml EP 管，加入 40μl 蒸餾水，200μl 試劑四，40μl 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為A 空白管。

6. 標(biāo)準(zhǔn)管：取 0.5 ml EP 管，加入 40μl 標(biāo)準(zhǔn)品，200μl 試劑四，40μl 試劑五，混勻后置于 30℃水浴保溫 20min，取 200μl 于微量玻璃比色皿/96 孔板，于 680nm 測(cè)定光吸收，記為A 標(biāo)準(zhǔn)管。

注意：空白管和標(biāo)準(zhǔn)管只需要測(cè)定一次。計(jì)算公式：

1. 按照樣本蛋白濃度計(jì)算

NP 活性單位定義：30℃每毫克蛋白每分鐘水解產(chǎn)生 1nmol 酪an酸為 1 個(gè)酶活單位。

NP 活性（nmol/min /mg prot）= C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷(Cpr×V1)÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷Cpr 2．按照樣本質(zhì)量計(jì)算

NP 活性單位定義：30℃每克樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1 nmol 酪an酸為 1 個(gè)酶活單位。

NP 活性（nmol/min /g 鮮重）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷（W×V1÷V2）÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷W

3. 按照液體體積計(jì)算

NP 活性單位定義：30℃每毫升樣品每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪an酸為 1 個(gè)酶活單位。

NP 活性（nmol/min/ml）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷V1÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）

1.  按照細(xì)胞數(shù)量計(jì)算

NP 活性單位定義：30℃每 10⁴ 個(gè)細(xì)胞每分鐘催化水解產(chǎn)生 1nmol 酪an酸為 1 個(gè)酶活單位。

NP 活性（nmol/min /10⁴ cell）=C 標(biāo)準(zhǔn)品×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）×V 反總÷（細(xì)胞數(shù)量×V1÷V2）÷T= 125×（A 測(cè)定管－A 對(duì)照管）÷（A 標(biāo)準(zhǔn)管－A 空白管）÷細(xì)胞數(shù)量

C 標(biāo)準(zhǔn)品：0.25 μ mol/ml 標(biāo)準(zhǔn)酪an酸溶液；V 反總：酶促反應(yīng)總體積，0.1ml；Cpr：粗酶液蛋白質(zhì)濃度（mg/ml）； V1：加入反應(yīng)體系中粗酶液體積（ml），0.02 ml；V2：提取液總體積（ml），1ml；T：催化反應(yīng)時(shí)間（min）， 10min；W：樣品質(zhì)量（g）。

注意事項(xiàng)：

臨用前配制的試劑配制好后 4℃保存，并且 3 天內(nèi)使用完畢。

中性蛋bai酶活性測(cè)定試劑盒   離子系列