α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶（α-L-Arabinofuranosidase, α-L-Af）

分光光度法 50 管/24 樣

正式測(cè)定前務(wù)必取 2-3 個(gè)預(yù)期差異較大的樣本做預(yù)測(cè)定測(cè)定意義：

α-L-Af 是一種能夠水解非還原呋喃阿拉伯糖殘基的糖苷酶類，使細(xì)胞壁阿拉伯半乳聚糖、阿拉伯甘露聚糖等中性糖不斷解離，促進(jìn)果膠的增溶和降解。由于果實(shí)成熟過(guò)程中常常伴隨著阿拉伯糖的喪失，該酶活性在果實(shí)成熟軟化中的研究具有重大意義。

測(cè)定原理：

α-L-Af 分解對(duì)硝基酚阿拉伯呋喃糖苷生成對(duì)-硝基ben酚，后者在 400nm 有最大吸收峰，通過(guò)測(cè)定吸光值升高速率來(lái)計(jì)算α-L-Af 活性。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶  糖代謝系列

組成：

試劑一：粉劑×1 瓶，-20℃保存；臨用前每瓶加入 5ml 蒸餾水，充分溶解備用；用不完的試劑仍-20℃保存。

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

自備儀器和用品：

可見(jiàn)分光光度計(jì)、臺(tái)式離心機(jī)、水浴鍋、可調(diào)式移液器、1ml 玻璃比色皿、研缽、冰和蒸餾水。

粗酶液提?。?/span>

1、細(xì)菌或培養(yǎng)細(xì)胞：先收集細(xì)菌或細(xì)胞到離心管內(nèi)，離心后棄上清；按照細(xì)菌或細(xì)胞數(shù)量（10⁴ 個(gè)）：提取液體積（ml）為 500~1000：1 的比例（建議 500 萬(wàn)細(xì)菌或細(xì)胞加入 1ml 提取液），超聲波破碎細(xì)菌或細(xì)胞（冰浴，功率 20％或 200W，超聲 3s，間隔 10s，重復(fù) 30 次）；15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

2、組織：按照組織質(zhì)量（g）：提取液體積(ml)為 1：5~10 的比例（建議稱取約 0.1g 組織，加入 1ml 提取液），進(jìn)行冰浴勻漿。15000g 4℃離心 10min，取上清，置冰上待測(cè)。

測(cè)定步驟：

1、分光光度計(jì)預(yù)熱 30min 以上，調(diào)節(jié)波長(zhǎng)至 400nm，蒸餾水調(diào)零。

2、樣本測(cè)定（在 EP 管中依次加入下列試劑）：

迅速混勻，放入 37℃準(zhǔn)確水浴 30min

充分混勻，400nm 處測(cè)定吸光值A，計(jì)算ΔA=A 測(cè)定-A 對(duì)照。每個(gè)測(cè)定管需設(shè)一個(gè)對(duì)照管。

α-L-Af 活性計(jì)算：

標(biāo)準(zhǔn)條件下測(cè)定的回歸方程為y =0.00585x -0.0027；x 為標(biāo)準(zhǔn)品濃度（nmol/ml），y 為吸光值。

（1） 按樣本蛋白濃度計(jì)算：

單位的定義：每mg 組織蛋白每min 產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基ben酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/mg prot)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(V 樣×Cpr)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷Cpr

（2） 按樣本鮮重計(jì)算：

單位的定義：每g 組織每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基ben酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/g 鮮重)=[(ΔA+0.0027)÷0.00585×V 反總]÷(W×V 樣÷V 樣總)÷T

=39.89×(ΔA+0.0027) ÷W

（3） 按細(xì)菌或細(xì)胞密度計(jì)算：

單位的定義：每 1 萬(wàn)個(gè)細(xì)菌或細(xì)胞每小時(shí)產(chǎn)生 1nmol 對(duì)-硝基ben酚定義為一個(gè)酶活性單位。

α-L-Af 活性(nmol/min/10⁴cell) =[(ΔA+0.0027) ÷0.00585×V 反總]÷(500×V 樣÷V 樣總)÷T

=0.08×(ΔA +0.0027)

Cpr：樣本蛋白質(zhì)濃度，mg/ml；V 反總：反應(yīng)體系總體積，0.5ml；V 樣：加入反應(yīng)體系中樣本體積，0.05ml；

V 樣總：加入提取液體積，1ml；W：樣本質(zhì)量，g； 500：細(xì)胞或細(xì)菌總數(shù)，500 萬(wàn)；T：反應(yīng)時(shí)間，30min。

α-L-阿拉伯呋喃糖苷酶  糖代謝系列