諾博萊德 細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒

細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒 常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號：P4949

產(chǎn)品名稱：細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡介：

中文名稱：細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒

規(guī)格：50T ; 100T

儲存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder P4949 細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒

細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從細(xì)胞和動物組織提取細(xì)胞質(zhì)膜蛋白。提取過程簡單方便。提取的膜蛋白不僅純度高，保持天然活性，而且絕少交叉污染。本試劑盒提取的蛋白可用于WesternBlotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gelshift凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

適用樣本：動物細(xì)胞

注：

1. 蛋白酶抑制劑未開蓋使用前也可以 2-8℃儲存。開蓋使用后-20℃儲存。

2. 蛋白酶抑制劑在 2-8℃低溫時是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或 37℃短時間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開蓋。

3. 試劑拆封后請盡快使用完。

產(chǎn)品簡介：

細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取試劑盒提供全套試劑，適用于從細(xì)胞和動物組織提取細(xì)胞質(zhì)膜蛋白。

提取過程簡單方便。提取的膜蛋白不僅純度高，保持天然活性，而且絕少交叉污染。

本試劑盒提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift 凝膠阻滯實驗、酶活性測定等下游蛋白研究實驗。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有 EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

本試劑盒提取的蛋白樣本含有高濃度的鹽成分，不可直接用于 2D 電泳，需要除鹽后再用于 2D 電泳。

自備試劑和儀器：

離心機、振蕩器、勻漿機/勻漿器、渦旋混勻器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒、離心管、吸頭、一次性手套

產(chǎn)品特點：

1. 使用方便，從細(xì)胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

2. 提取過程簡單方便，將蛋白提取的時間縮短至 1 小時。

3. 含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

4. 紫外檢測蛋白濃度時，背景干擾低。

5. 總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

6. 蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含 6

種獨立的蛋白酶抑制劑 AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、Pepstatin A、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

使用方法：

一、使用注意事項：

1. 旋帽離心管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋內(nèi)壁上的液體甩至管底，避免開蓋時液體灑落。

2. 實驗過程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個過程須保持樣品處于低溫。

3. 蛋白酶抑制劑儲存期間溶液如果出現(xiàn)沉淀，不影響使用，溶解后正常使用。

4. 可以根據(jù)自己實驗需要加入其它蛋白酶抑制劑單品。

5. Western 實驗內(nèi)參可以選用Na-K ATPase。

6. 提取液A 在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導(dǎo)致不容易分層。

7. 膜蛋白電泳時loading buffer 應(yīng)該避免煮沸。

8. 膜蛋白電泳時可以提高loading buffer 的SDS 含量。

二、操作步驟：

A. 細(xì)胞質(zhì)膜蛋白提取

1. 試劑準(zhǔn)備：

每 500μl 冷的蛋白提取液 A 中加入 5μl 試劑 B 和 2μl 蛋白酶抑制劑混合物，混勻后

置冰上備用。

【注】：

1) 根據(jù)需要處理的樣品數(shù)量準(zhǔn)備蛋白提取液，蛋白酶抑制劑混合物不可以一次全部加入提取液。

2) 加過蛋白酶抑制劑的提取液一周內(nèi)未使用完，再次使用前需要再次加入蛋白酶抑制劑。

3) 以下步驟中使用的蛋白提取液為此步配制好的含蛋白酶抑制劑的提取液。

4) 提取液 A 在使用前須一直置于 2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時會導(dǎo)致不容易分層。

2. 取 5-10×10⁶個以上細(xì)胞，在4℃，500×g 條件下離心 5 分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

【注】：

1) 貼壁細(xì)胞可以從培養(yǎng)器皿上消化下來或者用一次性細(xì)胞刮刀刮下來后處理，也可以直接原位裂解處理。

2) 原位處理時先小心吸取貼壁細(xì)胞的培養(yǎng)液，用冷PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干 PBS。加入適量冷的蛋白提取液 A，4℃振蕩 20-30 分鐘，至細(xì)胞充分裂解，

3) 用細(xì)胞刮刀刮一遍，將裂解液吸入另一干凈離心管。

4) 原位裂解時推薦提取液 A 使用量：60mm 培養(yǎng)皿 250 μl-500 μl；100mm 培養(yǎng)皿500μl-1ml；6 孔板200-250 μl/孔；24 孔板100 μl/孔；96 孔板50 μl/孔；75cm2 培養(yǎng)瓶500μl-1ml。

3. 用冷 PBS 洗滌細(xì)胞兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

【注】：

1) 2000×g，離心3-5 分鐘。

4. 細(xì)胞樣品中加入 300-500μl 冷的試劑 A，高速渦旋充分混勻。

【注】：

1) 細(xì)胞數(shù)量根據(jù)實驗情況調(diào)整，每次的裂解液用量并不是一定的，請根據(jù)實際情況調(diào)整。

2) 由于膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率。在條件允許的情況下，盡可能加大細(xì)胞上樣量。

5. 置 2-8℃振蕩 30 分鐘。

【注】：

1) 此步驟必須在2-8℃處理，不可在室溫下操作。

2) 裂解液用量并不是一定的，請根據(jù)細(xì)胞數(shù)量實際情況調(diào)整。大約細(xì)胞樣本和提取液體積比1:5-10，根據(jù)實際情況調(diào)整提取液A 用量。

3) 由于質(zhì)膜蛋白含量較少，需要較多的細(xì)胞才能保證得率。

4) 如果沒有2-8℃持續(xù)振蕩條件，也可直接置2-8℃冰箱靜置，稍微延長處理時間，中間每隔10 分鐘用移液器吹打混勻即可。

6. 高速渦旋振蕩 5 秒，然后在 4℃，12000×g 條件下離心 5 分鐘。

7. 將上清吸入另一干凈離心管，37℃水浴 5-10 分鐘。

8. 在 37℃下 500×g -1000×g 力離心 3 分鐘。

【注】：

1) 此步驟必須37℃條件下離心。

2) 如果離心機不可控溫，可以不離心，延長上一步驟水浴時間，至溶液分層清晰即可?；蛘咴谑覝貤l件下離心，縮短離心時間至1 分鐘。

9. 此時溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為 30-50μl。

【注】：

1) 下層為粘稠狀液體。

10. 小心移除上層，用 50-150μl 冷的試劑 C 溶解下層質(zhì)膜蛋白部分，充分混勻，即得細(xì)胞質(zhì)膜蛋白。

【注】：

1) 膜蛋白比較難溶解，不能很快溶解混勻，可以在加入溶解液后稍微吹打混勻，然后置于4℃冰箱靜置至溶解。中途用移液器輕輕吹打混勻一次。靜置后取出再次用移液器稍微吹打混勻即可。

2) 靜置直至管底透明膠狀物wan全溶解。

11. 將上述蛋白提取物定量后分裝于-80℃冰箱保存?zhèn)溆没蛑苯佑糜谙掠螌嶒灐?/span>

【注】：

1) 建議用BCA 法進(jìn)行蛋白定量。

2) 蛋白樣品-80℃存放一年沒有問題。注意不要被蛋白酶水解掉，不要被細(xì)菌污染。

B. 組織樣本質(zhì)膜蛋白提取

1. 取適量組織樣本用手shu剪刀盡可能剪碎，加入冷的蛋白提取液 A，用組織勻漿機/勻漿器勻漿至無明顯肉眼可見固體，將勻漿吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

【注】：

1) 每個樣大約50-100 mg 組織。樣品較大可以相應(yīng)增加提取液用量。

2. 按照細(xì)胞蛋白的提取方法的第 5 步驟往下操作即可。

注意事項：

1. 正式實驗前請選取幾個樣本做預(yù)實驗，以優(yōu)化實驗條件，取得優(yōu)良實驗效果。

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開蓋前請短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開蓋時試劑損失。

3. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會影響使用效果。

4. 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會導(dǎo)致錯誤的結(jié)果。

5. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

6. 實驗后完成后所有樣品及接觸過的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。

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