諾博萊德 高爾基體膜蛋白提取試劑盒

高爾基體膜蛋白提取試劑盒 常備現(xiàn)貨

產(chǎn)品貨號(hào)：P4922

產(chǎn)品名稱：高爾基體膜蛋白提取試劑盒

產(chǎn)品規(guī)格：50T/100T

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

中文名稱：高爾基體膜蛋白提取試劑盒

規(guī)格：50T ; 100T

儲(chǔ)存條件：2-8℃，1 year

具體產(chǎn)品的參數(shù)以收到產(chǎn)品說(shuō)明書的參數(shù)為準(zhǔn)

NobleRyder P4922 高爾基體膜蛋白提取試劑盒

適用樣本

動(dòng)物細(xì)胞/組織

產(chǎn)品介紹

高爾基體膜蛋白提取試劑盒可用于各種動(dòng)物細(xì)胞和實(shí)體軟、硬組織樣本的高爾基體膜蛋白的提取。

本試劑盒提取的蛋白可用于 Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性 分析、Gel shift 凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有 EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容。

注：

1. 蛋白酶抑制劑未開(kāi)蓋使用前也可以2-8℃儲(chǔ)存。開(kāi)蓋使用后-20℃儲(chǔ)存。

2. 蛋白酶抑制劑在2-8℃低溫時(shí)是固體狀態(tài)，從冰箱取出后恢復(fù)至室溫或37℃短時(shí)間水浴，變成液體狀態(tài)后離心至管底部再開(kāi)蓋。

3. 試劑拆封后請(qǐng)盡快使用完！

產(chǎn)品簡(jiǎn)介：

高爾基體膜蛋白提取試劑盒可用于各種動(dòng)物細(xì)胞和實(shí)體軟、硬組織樣本的高爾基體膜蛋白的提取。

本試劑盒提取的蛋白可用于Western Blotting、蛋白質(zhì)電泳、免疫沉淀、ELISA、轉(zhuǎn)錄活性分析、Gel shift凝膠阻滯實(shí)驗(yàn)、酶活性測(cè)定等下游蛋白研究實(shí)驗(yàn)。

本試劑盒提取的蛋白為具有天然蛋白構(gòu)象的活性蛋白。

本試劑盒中不含有EDTA，與金屬螯和層析等下游應(yīng)用兼容

自備試劑和儀器

離心機(jī)、振蕩器、勻漿機(jī)/勻漿器、渦旋混勻器、移液器、冰箱、冰盒，PBS緩沖液、蛋白定量試劑盒，離心管、吸頭、一次性手套

產(chǎn)品特點(diǎn)：

1、使用方便，從細(xì)胞，組織中提取蛋白不需經(jīng)過(guò)研磨、反復(fù)凍融、超聲破碎等前處理。

2、提取過(guò)程簡(jiǎn)單方便。

3、含蛋白穩(wěn)定劑，提取的蛋白穩(wěn)定。

4、紫外檢測(cè)蛋白濃度時(shí)，背景干擾低。

5、總蛋白提取液含多種有效成分，可以充分釋放胞漿蛋白、核蛋白和膜蛋白，又可結(jié)合釋出的蛋白防止沉淀。

6、蛋白酶抑制劑抑制了蛋白的降解，蛋白酶抑制劑配方優(yōu)化。蛋白酶抑制劑混合物包含 6 種立的蛋白酶抑制劑 AEBSF、Aprotinin、Leupeptin、PepstatinA、Bestatin、E-64，每一種抑制劑可特異性抑制某一種或幾種蛋白酶活性。該混合物優(yōu)化的組成使其可以抑制幾乎所有重要的蛋白酶活性，包括絲an酸蛋白酶、半胱an酸蛋白酶、天冬氨酸蛋白酶、丙氨酰-氨基肽酶等。

使用方法：

一、使用注意事項(xiàng)：

1. 正式實(shí)驗(yàn)前請(qǐng)選取幾個(gè)樣本做預(yù)實(shí)驗(yàn)，以優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件，取得優(yōu)良實(shí)驗(yàn)效果

2. 螺旋蓋微量試劑管裝的試劑在開(kāi)蓋前請(qǐng)短暫離心，將蓋和管內(nèi)壁上的液體離心至管底，避免開(kāi)蓋時(shí)試劑損失。

3. 實(shí)驗(yàn)過(guò)程中的所有試劑須預(yù)冷；所有器具須放-20℃冰箱預(yù)冷。整個(gè)過(guò)程須保持樣品處于低溫。

4. 最好使用Dounce勻漿器勻漿，如果沒(méi)有Dounce勻漿器，也可用普通玻璃勻漿器勻漿，但是高爾基體蛋白回收率會(huì)下降。

5. 用Dounce勻漿器勻漿是高爾基體膜蛋白提取的關(guān)鍵的步驟，故勻漿前最好先通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)確定不同組織樣本的最適勻漿次數(shù)，方法是每勻漿5-10次后，取2-3μl勻漿液到載玻片上，然后在相差顯微鏡下觀察，完整細(xì)胞數(shù)量降低到20%以下為佳。此鏡檢步驟非必須步驟，但是會(huì)影響高爾基體膜蛋白的回收率。在樣本極難獲取的實(shí)驗(yàn)中，務(wù)必做鏡檢。

6. 提取液C在使用前須一直置于2-8℃條件，否則下游膜蛋白提取時(shí)會(huì)導(dǎo)致不容易分層。

7. 膜蛋白電泳時(shí)loading buffer應(yīng)該避免煮沸。

8. 膜蛋白電泳時(shí)可以提高loading buffer的SDS含量。

9. 禁止與其他品牌的試劑混用，否則會(huì)影響使用效果。

10. 樣品或試劑被細(xì)菌或真菌污染或試劑交叉污染可能會(huì)導(dǎo)致錯(cuò)誤的結(jié)果。

二、操作步驟

提取液準(zhǔn)備：

每200ul冷的蛋白提取液C中加入1ul蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

每200ul冷的蛋白提取液D中加入1ul蛋白酶抑制劑混合物，混勻后置冰上備用。

細(xì)胞高爾基體膜蛋白提取

1.取1—2×10⁷個(gè)細(xì)胞，在4℃，500×g條件下離心2-3分鐘，小心吸取培養(yǎng)基，盡可能吸干，收集細(xì)胞。

2.用冷PBS洗滌兩次，每次洗滌后盡可能吸干上清。

3.加入500ul冷的試劑A，置冰上10分鐘。

4.用Dounce勻漿器勻漿充分勻漿。

5.然后在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。

6.棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

7.在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。

8.棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

9.在4℃，10000×g力條件下離心10分鐘。

10.棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

11.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。棄上清。

12.在沉淀中加入400ul冷的試劑B，混勻。

13.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。

14.棄上清，沉淀中加入100-200ul冷的蛋白提取液C，充分混勻。

15.在2-8℃條件下振蕩30-40分鐘，至沉淀充分裂解，無(wú)明顯沉淀。

16.在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。

17.將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水浴10分鐘。

18.在37℃，1000×g力離心5分鐘，此時(shí)溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為20-30ul。

19.小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。

20.用50-100ul冷的試劑D膜蛋白溶解液溶解下層高爾基體膜蛋白部分，即得高爾基體膜蛋白。

21.將高爾基體膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

組織高爾基體膜蛋白提取：

1.取50-100mg新鮮動(dòng)物組織樣本，用PBS洗滌干凈。

2.用剪刀盡可能剪碎，用冷PBS洗滌兩次。

3.加入500ul冷的試劑A，置冰上10分鐘。

4.用Dounce勻漿器充分勻漿30-40下，至無(wú)明顯固體團(tuán)塊。

5.然后在4℃，1000×g力條件下離心5分鐘。

6.棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

7.在4℃，3000×g力條件下離心10分鐘。

8.棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

9.在4℃，10000×g力條件下離心10分鐘。

10.棄沉淀，將上清吸入另一預(yù)冷的干凈離心管。

11.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。棄上清。

12.在沉淀中加入400ul冷的試劑B，混勻。

13.在4℃，25000×g力條件下離心30分鐘。

14.棄上清，沉淀中加入100-200ul冷的蛋白提取液C，充分混勻。

15.在4℃條件下振蕩30-40分鐘，至沉淀充分裂解，無(wú)明顯沉淀。

16.在4℃，12000×g條件下離心5分鐘。棄沉淀，收集上清。

17.將上清吸入另一干凈離心管，在37℃水浴10分鐘。

18.在37℃，1000×g力離心5分鐘，此時(shí)溶液分為兩層，下層是膜蛋白約為20-30ul。

19.小心移除上層液體，收集上層部分留作備用分析。

20.用50-100ul冷的試劑D膜蛋白溶解液溶解下層高爾基體膜蛋白部分，即得高爾基體膜蛋白。

21.將高爾基體膜蛋白樣品，置冰箱備用或直接用于下游實(shí)驗(yàn)。

注：

①蛋白濃度低？

處理部分樣本時(shí)可能沒(méi)有裂解wan全，導(dǎo)致蛋白濃度低。只要適當(dāng)延長(zhǎng)試劑C的處理時(shí)間即可。最好在持續(xù)振蕩的條件下處理，沒(méi)有振蕩器也可間隔幾分鐘用吸頭吹打混勻。

②用什么方法定量蛋白？

建議用BCA法。不適合用Bradford法，因?yàn)樵噭〢中含有干擾Bradford法的組份，導(dǎo)致定量不準(zhǔn)。如果已經(jīng)進(jìn)行過(guò)透析處理或者用脫鹽柱改換過(guò)緩沖體系，則可以用Bradford法定量。

③提取的蛋白具有活性嗎？

本試劑盒不含有離子型去垢劑組份，不破壞蛋白的結(jié)構(gòu)，沒(méi)有對(duì)蛋白質(zhì)之間原有的相互作用的破壞，蛋白均保持其天然構(gòu)象和活性。

注意事項(xiàng)：

1. 本試劑盒僅供科學(xué)研究使用，不可用于診斷或治療。

2. 最好使用一次性吸頭、管、瓶或玻璃器皿，可重復(fù)使用的玻璃器皿必須在使用前清洗并che底清除殘留清潔劑。

3. 實(shí)驗(yàn)后完成后所有樣品及接觸過(guò)的器皿應(yīng)按照規(guī)定程序處理。

4. 避免皮膚或粘膜與試劑接觸。

高爾基體膜蛋白提取試劑盒 常備現(xiàn)貨

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